Новые перспективы терапии глиобластом: анализ иммуногенных механизмов ферроптоза

Исследование выполняется на базе двух университетов:

Институт биологии и биомедицины ННГУ им. Н.И. Лобачевского с использованием оборудования центра коллективного пользования «Молекулярной биологии и нейрофизиологии»
Лаборатория исследования и терапии гибели клеток (CDIT), кафедра анатомии и регенерации человека, Университет Гента, Бельгия;

Руководитель исследования: к.б.н., доцент каф. нейротехнологий ИББМ Мищенко Татьяна Александровна

Состав исследовательской группы:

Ведунова Мария Валерьевна – д.б.н., профессор, директор ИББМ
Дмитрий Крысько – профессор, Университет Гента (Бельгия), руководитель Лаборатории исследования и терапии гибели клеток (CDIT)
Балалаева Ирина Владимировна – к.б.н., доцент кафедры биофизики ИББМ
Горшкова Екатерина Николаевна – к.б.н.– доцент кафедры молекулярной биологии и иммунологии ИББМ
Гурьев Евгений Леонидович – к.б.н., старший научный сотрудник кафедры биофизики ИББМ
Клименко Мария Олеговна – преподаватель кафедры общей и медицинской генетики ИББМ
Михеева Ульяна Александровна – лаборант-исследователь кафедры общей и медицинской генетики ИББМ
Оладжиде Олувабуколами Джой – аспирант кафедры общей и медицинской генетики ИББМ
Куликов Сергей Сергеевич, Горбунова Елизавета Юрьевна, Авласенко Дарья Андреевна, Валерианова Ксения Андреевна, Грейзи Сара, Кузнецова Наталия Денисовна – студенты кафедры нейротехнологий ИББМ
Варламова Светлана Анатольевна, Ведунова Анна Александровна – студенты кафедры молекулярной биологии и иммунологии ИББМ
Колеватова Анна Николаевна – студент кафедры общей и медицинской генетики ИББМ

Цель исследования – определение ключевого профиля молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPs)в реализации иммуногенных свойств ферроптоза в отношении клеток глиобластомы

Актуальность исследования

Мультиформная глиобластома – наиболее агрессивный тип опухолей головного мозга с высокой частотой встречаемости среди населения и неутешительными прогнозами для пациентов. Классическая схема лечения включает хирургическую резекцию опухоли, химиотерапию с использованием темозоломида в комбинации с лучевой терапией, однако лишь около 40% отвечают на лечение, прежде чем возникает развитие резистентности и рецидив опухоли.

Разработка стратегий преодоления резистентности глиобластом к проводимой терапии и достижения эффективной гибели опухолевых клеток – очень важное направление для медицины.

Для глиобластом характерно формирование иммуносупрессивного микроокружения, подавляющего инфильтрацию и активацию Т-клеток и снижающего эффективность проведения иммунотерапии. Подходы, основанные на индукции иммуногенной клеточной смерти (англ. ICD), привлекают большое внимание в качестве мощного инструмента для создания иммуноблагоприятного микроокружения опухоли, а также движущей силы для эффективного контроля роста опухоли и формирования долговременной иммунологической памяти, предотвращающей рецидив опухоли.

Описание исследования и методы

В проекте 2022 были оценены иммуногенные свойства ферроптоза в отношении клеток глиомы мыши. Проект направлен на изучение роли молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMPs) в проявлении иммуногенности клеток глиомы, погибающих по пути альтернативной апоптозу и некроптозу регулируемой формы клеточной смерти – ферроптоза, а также исследование эффективности профилактических и терапевтических ДК вакцин, загруженных ферроптотическими клетками глиомы, в экспериментальной модели опухоли in vivo.

Изображение первичной культуры клеток глиомы человека
Фото: Екатерина Марасанова

Методом CRISPR/Cas9 была проведена генетическая трансформация клеток глиомы GL261 c целью получения стабильной клеточной линии с нокаутом гена ключевого DAMPs – кальретикулина (GL261-bCRT). Методом оптического сортинга были получены жизнеспособные моноклональные культуры GL261-bCRT, эффективность которых анализировалась методом ПЦР и секвенированием. Было подтверждено отсутствие экспрессии белка CRT в полученной постоянной клеточной линии GL261-bCRT методом вестерн-блот.

Охарактеризован профиль фенотипического созревания дендритных клеток (ДК) в присутствии клеток глиомы GL261-bCRT на поздних (24 ч) стадиях ферроптоза и проведено сравнение с профилем ДК в присутствии клеток глиомы исходной линии GL261. Оценена эффективность профилактических ДК вакцин на основе лизатов клеток GL261-bCRT в модели ортотопической глиомы in vivo. Проведена генетическая трансформация клеток глиомы GL261 c целью получения стабильной клеточной линии с нокаутом гена ключевого DAMPs – амфотерина (GL261-bHMGB1). Методом оптического сортинга было получено 19 моноклональных культур GL261-bHMGB1, эффективность которых в настоящее время анализируются методом ПЦР и секвенированием. Показано, что на эффективность ДК вакцин, основанных на лизатах ферроптотических клеток глиомы, можно повлиять, блокируя ключевые DAMPs, что говорит о их важности в реализации противоопухолевого иммунного ответа.

Исследованы особенности гибели культуры клеток глиомы мыши GL261 и первичной культуры клеток глиомы человека при применении индуктора ферроптоза и препарата первой линии химиотерапии темозоломида (TMZ). Показано, что первичные культуры клеток глиомы человека обладают большей резистентностью к действию TMZ по сравнению с клетками постоянной клеточной линии мыши GL261.

Применение индуктора ферроптоза приводит к выраженной активации процессов гибели TMZ-индуцированных клеток через 24 ч. после начала воздействия. При сочетанном применении индуктора и TMZ наибольший вклад в гибель культур GL261 вносит активация механизмов ферроптоза, в первую опосредованных накоплением липидных радикалов, в то время как для первичной культуры клеток глиомы человека показана активация смешанного типа клеточной смерти.

Проведена комплексная оценка эффективности применения трехмерных конструктов на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты в качестве интраоперационной системы доставки темозоломида для терапии глиом в ортотопической модели опухоли in vivo.

В настоящее время с использованием мышиной модели нейрон-глиальных сетей in vitro проводятся работы по изучению особенностей функционирования нейрон-глиальных сетей клеток головного мозга в присутствии ферроптотических клеток глиомы для комплексной оценки безопасности разрабатываемой нами стратегии иммунотерапии и будущих терапевтических разработок на основе индукции ферроптоза с целью преодоления резистентности клеток глиобластомы к другим видам регулируемой клеточной гибели и проводимой терапии.

Публикации на основе исследования:

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (РНФ, проект no. 22-15-00376, https://rscf.ru/en/project/22-15-00376/) 2022-2024

Анонсы