Новые лекарства при аутоиммунных заболеваниях (мегагрант 2014-2016 гг)

Проект «Новые лекарства и принципы анти-ФНО терапии при аутоиммунных заболеваниях» (мегагрант 2014-2016 гг)

Для выполнения данного проекта под руководством ведущего ученого, члена-корреспондента Российской Академии Наук, профессора Сергея Артуровича Недоспасова в рамках мегагранта Правительства Российской Федерации, выделяемого на конкурсной основе для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования, в 2014 году создана лаборатория экспериментальной иммунологии.

Цель проекта:

Сравнительная оценка нескольких новых блокаторов ФНО*, создание условий для их последующего производства и клинического применения.

Задачи проекта: 

— Создать и оценить в экспериментальных системах на мышах нового типа блокаторы ФНО, которые бы фармакологически нейтрализовали ФНО только из основного патогенного источника.
— Отработать экспериментальную модель фармакологической блокировки ФНО человека на «гуманизованных» мышах при артрите с использованием коммерчески доступных анти-ФНО-препаратов (Infliximab или Adalimumab, Etanercept и Certolizumab pegol).
— Изучить патогенез ФНО при аутоиммунных заболеваниях с помощью недавно созданных «репортерных» мышей и систем прижизненного имиджинга, разработанных в Медицинской академии и ННГУ.
— Создать платформу для доклинической оценки нескольких новых химеризованных и гуманизованных антагонистов ФНО на основе антител.
— Разработать панель новых биспецифических ФНО-блокаторов на основе однодоменных антител верблюда и способных блокировать ФНО на поверхности определенных типов клеток (например, макрофаги или B-клетки). Определить сродство и фармокинетику новых биспецифических антител и оценить их эффективность в экспериментальных болезнях на гуманизованных мышах.
— Оценить влияние Etanercept/Enbrel по сравнению с Infliximab и Certolizumab pegol на системные уровни IgA и состав микробиоты в гуманизованных мышах.

Результаты (проекты):

ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ КОНСТРУКТА, КОДИРУЮЩЕГО СЛИТНЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИТЕЛА ЛАМЫ, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФНО, И ЦВЕТНОГО БЕЛКА, ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО В КРАСНОЙ ЧАСТИ СПЕКТРА.

Фактор некроза опухоли (ФНО) является провоспалительным цитокином. В норме, ФНО играет важную роль в защите организма от патогенов, а также участвует в формировании иммунной системы. Однако, при многих аутоиммунных заболеваниях (в частности, при ревматоидном артрите и болезни Крона) отмечена гиперэкспрессия ФНО. В связи с этим, важным для понимания роли ФНО как в патологических, так и в нормальных процессах является изучение сайтов экспрессии этого цитокина. У представителей семейства Camelidae помимо обычных антител присутствуют особые антитела, состоящие только из тяжёлых цепей. Несмотря на отсутствие лёгких
цепей, такие антитела с высокой аффинностью связывают антиген. Описаны одноцепочечные рекомбинантные антитела, представляющие собой вариабельный участок тяжёлой цепи антитела ламы. Эти антитела представляют собой наименьший известный антиген-распознающий элемент. Такие одноцепочечные антитела были получены и против ФНО человека. Благодаря достаточно высокой аффинности и
крайне малым размерам этих антител их можно использовать для создания слитных белков (fusion proteins), в частности с флуоресцентными белками. Одним из наиболее подходящих для визуализации структур на уровне целого организма флуоресцентных белков является белок Katushka. Нами были получены конструкты, кодирующие слитные белки одноцепочечных рекомбинантных антител, связывающих ФНО человека, и Katushka. Полученные конструкты были проэкспрессированы в бактериальной системе (E. сoli). Рекомбинантный белок сохранил способность к флуоресценции в красной области спектра. В настоящее время изучаются биологические свойства слитного белка, в том числе способность слитного белка связывать ФНО и визуализировать в организме места его продукции и накопления. Использование связывающего ФНО цветного слитного белка в качестве маркёра в экспериментах на мышиных моделях (в первую очередь, на мышах, “гуманизованных” по ФНО локусу), позволит изучить, в каких тканях происходит экспрессия этого цитокина, в том числе и при заболеваниях, являющихся моделями заболеваний человека.

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ TNF В МОДЕЛИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕПОРТЕРНЫХ МЫШЕЙ С КРАСНЫМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ БЕЛКОМ

Ранее в лаборатории ведущего ученого была создана новая линия репортерных мышей (TNF-2A-Кat), содержащих в виде трансгена фрагмент гена TNF с его регуляторными элементами, слитый с геном красного флуоресцентного белка Катюшка (Kat). Таким образом, в геном линии трансгенных TNF-2A-Кat репортерных мышей вставлена генетическая конструкция, позволяющая совместно экспрессировать ген TNF и ген-репортер флуоресцентного белка. Конструкция содержит большинство известных регуляторных элементов гена TNF, что позволяет идентично регулировать экспрессию трансгена и гена TNF клетки. Совместно с НИИ Биомедицинских технологий НижГМА были получены данные по флуоресцентному in vivo имиджингу TNF-2A-Кat репортерных мышей.Так, при сравнении флуоресцентных изображений in vivo было обнаружено, что интенсивность сигнала флуоресценции некоторых тканей TNF-2A-Kat мышей, в частности, кожи, значительно выше по сравнению с интенсивностью сигнала от тканей мышей дикого типа:

Типичные флуоресцентные изображения, полученные in vivo на мышах TNF-2A- Kat (верхний ряд) и мышах дикого типа (нижний ряд) : А – со стороны спины, Б – с левого бока, В – со стороны живота (яркие желтые пятна являются артефактом аутофлуоресценции).

При сравнительном флуоресцентном имиджинге ex vivo внутренних органов TNF-2A-Kat мышей и мышей дикого типа, таких как мышцы, кишечник, желудок, сердце, селезёнка, почки, лимфатические узлы, печень и лёгкие животных. Оценка флуоресценции органов показала, что хотя интенсивность сигнала от кожи, мышц, кишечника, лимфоузлов и легких была выше у TNF-2A-Kat мышей, статистически значимые отличия в интенсивности флуоресценции между двумя группами мышей наблюдались только для кожи и мышечной ткани. Этот результат, полученных на наивных здоровых мышах, разводка которых происходит в SPF виварии, позволил предположить, что активация гена TNF в клетках кожи может быть обусловлена эффектами микробиоты. Эта возможность сейчас исследуется с помощью применения антибиотиков, а также расширением анализа на эмбриональную стадию развития мышей, так как считается, что заселение микробиотой происходит после рождения.

Флуоресцентный имиджинг Aldara-индуцированного псориаза у мышей TNF-2A-Kat

Поскольку репортерные мыши позволили выявить «кожный фенотип» в экспрессии TNF у наивных мышей, возник вопрос об уровне экспрессии этого цитокина в условиях экспериментального воспаления кожи, такого как псориаз. При проведении сравнительного флуоресцентного имиджинга Aldara-индуцированного псориаза у мышей TNF-2A-Kat и мышей дикого типа было отмечено, что после серии последовательных нанесений препарата интенсивность сигнала флуоресценции в зоне заболевания у мышей TNF-2A-Kat значительно увеличивалась по сравнению с контрольным сигналом от здорового участка кожи, тогда как при индукции псориаза у мышей дикого типа подобных различий в интенсивности сигнала флуоресценции между участком кожи с псориазом и участком нормальной кожи не наблюдалось.

Флуоресцентный имиджинг in vivo и фотографии мыши TNF-2A-Kat (а) и мыши дикого типа (б) в условиях экспериментального псориаза, вызываемого препаратом AldaraТМ.

Наблюдение флуоресценции кожи мышей in vivo в динамике после нанесения псориаз-индуцирующего препарата AldaraТМ показало, что несмотря на формирование псориатических бляшек на коже, изменения сигнала, регистрируемого с поверхности у мышей дикого типа, не наблюдалось. Для мышей TNF-2A-Kat было характерно увеличение сигнала флуоресценции в зоне предполагаемой патологии начиная с 3-го дня после нанесения препарата по 7й день анализа, что, вероятно, свидетельствует о повышенном уровне продукции TNF. С помощью установки для многофотонной томографии MPTflex (Jenlab, Германия) были полученыin vivo изображения участков кожи TNF-2A-Kat репортерных мышей после 7 дней нанесения препарата, а также наивных TNF-2A-Kat репортерных мышей, не подвергавшихся воздействиям AldaraTM. Проводили сканирование кожи по глубине с получением Z-стеков с шагом 5 мкм. Анализ изображений показал, что у TNF-2A-Kat репортерных мышей после нанесения препарата AldaraТМ наблюдается значительное утолщение рогового слоя эпидермиса и избыточное количество кератиноцитов по сравнению с интактным участком кожи, что является признаками псориаза:

In vivo изображения псориатического участка кожи TNF-2A-Kat репортерной мыши (А) и здорового участка кожи (Б). Глубина слоя указана над изображениями. Красный канал: автофлуоресценция, двухфотонное возбуждение фемтосекундным лазером 750 нм. Зеленый канал: коллаген, генерация второй гармоники. Регистрация флуоресценции в диапазоне 409-660 нм.

СОЗДАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ, ОЧИСТКА И ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА ОСНОВЕ МИНИ-АНТИТЕЛ А9

Одной из основных научных идей проекта, осуществляемого в лаборатории экспериментальной иммунологии, является новый подход к антицитокиновой терапии, основанный на создании более специфических блокаторов TNF, которые будут избирательно нейтрализовать патогенный TNF из конкретных клеточных источников. Для его осуществления на базе уникальных однодоменных антител мозоленогих (ламы, верблюды) были сконструированы биспецифические анти-TNF белки, которые могут нейтрализовать TNF, экспрессируемый макрофагами.

Схема генетических конструкций, кодирующих антитело, связывающееся с TNF и макрофагальным маркером F4/80

Экспрессию белков проводили в бактериальной системе (E. coli, штамм Rosetta 2(DE3)pLysS). Очистка осуществлялась с помощью жидкостной аффинной хроматографии на колонках с Ni-NTA Agarose смолой. Затем, для переведения в HEPES-буфер, проводили 3 раунда диализа. Присутствие и концентрацию белка в элюате оценивали по изменению оптической плотности раствора при длине волны 280 нм, с помощью спектрофотометра при 320-340 нм в реакции с трихлоруксусной кислотой, а также методом электрофореза в ПААГ. Для обеспечения стабильности препаратов белков BV1, BV1c и BV1mut были использованы различные химические стабилизаторы, которые согласно нормативам Федерального закона «О лекарственных средствах» являются безопасными в производстве и применении терапевтических препаратов. Максимальная стабильность белков наблюдалась при присутствии в растворе 10% D(+)глюкозы или D(+)сорбитола. Кроме того, добавление к раствору белков 50 мM аргинина и 50 мM глутаминовой кислоты увеличивало их растворимость. Для предотвращения образования спонтанных внутри- и межмолекулярных S-S связей в раствор была введена окислительно-восстановительная пара 25mM L-аскорбиновая кислота/20 mcM CuSO4. Для определения эффективности связывания белков с TNF был использован метод ИФА, который основан на «сэндвич» – гибридизации. Максимальная чувствительность полученных препаратов антител составила около 5 нг/мл рекомбинантного TNF, что свидетельствует о высокой эффективности взаимодействия BV1, BV1c и BV1mut с белком-«мишенью».

Препараты белков BV1, BV1c и BV1mut после очистки и оптимизации стабильности.

Оценку способности полученными рекомбинантными антителами блокировать TNF проводили с помощью цитотоксического MTT-теста на клетках линии WEHI-164. По результатам теста все три белка обладали ингибирующей активностью по отношению к TNF, и, в концентрации около 100 нМ, полностью блокировали действие TNF, тем самым сохраняя 100% выживаемость клеток.

Кривые выживаемости клеток линии WEHI-164 после взаимодействия с TNF в концентрации 200ЕД и белков BV1, BV1-c, BV1-mut в разных концентрациях. Данные обрабатывались в программе GraphPadPrism с помощью метода наименьших квадратов. Показаны 95% доверительные интервалы.